Uracil DNA Glikosilase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG atanapi UDG) nyaéta klon rékombinan E.coli kalayan beurat molekul 25 kDa.Ieu ngatalisan sékrési uracil bébas tina uracil-ngandung single-stranded jeung ganda-stranded DNA, sarta teu aktif ngalawan RNA, sarta bisa dipaké pikeun nyegah kontaminasi produk amplifikasi PCR.Prinsip tindakan dumasar kana kanyataan yén lamun dUTP disubstitusi pikeun dTTP dina réaksi PCR sarta produk amplifikasi PCR nu ngandung basa dU kabentuk, énzim bisa selektif megatkeun beungkeut glikosidik basa U dina untaian tunggal jeung ganda-stranded. DNA sareng nguraikeun produk amplifikasi PCR.
Aplikasi Disarankeun
Amplifikasi Pencegahan Kontaminasi
Kaayaan Panyimpenan
-20 ° C pikeun neundeun jangka panjang, kudu dicampur ogé saméméh pamakéan, ulah sering freeze-ngalembereh.
Panyangga gudang
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabiliser, 50% Gliserol.
Harti Unit
Jumlah énzim anu diperlukeun pikeun nguraikeun 1µg DNA untai tunggal anu ngandung basa dU dina 1 jam dina suhu 37°C nyaéta 1 unit.
Kontrol kualitas
1.SDS-PAGE purity electrophoretic leuwih gede ti 98%
2.Sensitipitas amplifikasi, kontrol bets-to-batch, stabilitas
3.Saatos 1U of UNG dirawat di 50 ℃ salila 2mins, citakan ngandung U handap 103 salinan kudu sagemblengna didegradasi tur euweuh produk amplifikasi bisa dihasilkeun.
4.Henteu aya kagiatan nukléase éksogén
parentah
| Komponén | Volume (μL) | Konsentrasi ahir |
| 10 × PCR Buffer (gratis dNTP, Mg²+gratis) | 5 | 1 × |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ngaganti dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Campura | 2 | 1 × |
| Citakan | - | <1 μg/réaksi |
| ddH₂O | Ka 50 | - |
Catetan: a: Lamun dipaké pikeun qPCR / qRT-PCR, usik fluoresensi kudu ditambahkeun kana sistem réaksi.Biasana, konsentrasi primer ahir 0,2 μM tiasa masihan hasil anu saé;lamun kinerja réaksi goréng, konsentrasi primer bisa disaluyukeun dina rentang 0.2-1 μM.Biasana, konsentrasi usik dioptimalkeun dina rentang 0.1-0.3 μM.Percobaan gradién konsentrasi bisa dipigawé pikeun manggihan kombinasi pangalusna tina primer jeung usik.
Catetan
1.Énzim UNG tiasa dianggo pikeun ngaleungitkeun produk amplifikasi dUTP anu kacemar tina sistem réaksi sateuacan réaksi amplifikasi PCR, teras pikeun nyegah hasil positip palsu kusabab kontaminasi produk.
2.Suhu optimal pikeun énzim UNG dipaké dina réaksi PCR anti kontaminasi umumna 50 ℃ pikeun 2mins;kaayaan inactivation nyaeta 95 ℃ pikeun 5mins.
3.Hindarkeun sering freeze-thaw, sareng ulah kakeunaan fluktuasi suhu anu ageung.
4.Gén anu béda pikeun diamplifikasi gaduh efisiensi panggunaan anu béda tina dUTP sareng sensitipitas kana énzim UNG, janten, upami panggunaan sistem UNG nyababkeun panurunan sensitipitas deteksi, sistem réaksi kedah disaluyukeun sareng dioptimalkeun, upami anjeun peryogi dukungan téknis, mangga ngahubungi pausahaan urang.
