Protéinase K mNGS (cair)
Protéinase K nyaéta protease sérin anu stabil kalayan spésifisitas substrat anu lega.Éta nguraikeun seueur protéin dina kaayaan asli bahkan ku ayana detergent.Bukti tina studi kristal sareng struktur molekul nunjukkeun yén énzim kalebet kulawarga subtilisin kalayan triad katalitik situs aktif (Asp).39-Milikna69-Ser224).Situs utama pembelahan nyaéta beungkeut péptida anu padeukeut sareng gugus karboksil asam amino alifatik sareng aromatik kalayan gugus amino alfa anu diblokir.Biasana dianggo pikeun spésifisitas anu lega.Protéase K ieu dirarancang khusus pikeun mNGS.Dibandingkeun sareng protéinase K anu sanés, éta ngandung kontaminasi asam nukléat langkung sakedik sareng kinerja énzimatik anu sami, anu langkung saé tiasa mastikeun aplikasi mNGS hilir.
Kaayaan Panyimpenan
2-8 ℃ salila 2 taun
Spésifikasi
| Penampilan | Cairan teu warnaan dugi ka coklat terang |
| Kagiatan | ≥800 U/ml |
| Konsentrasi protéin | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Euweuh nu dideteksi |
| DNase | Euweuh nu dideteksi |
| RNase | Euweuh nu dideteksi |
Pasipatan
| Nomer EC | 3.4.21.64(Rekombinan tina albeum Tritirachium) |
| Titik isoelektrik | 7.81 |
| pH optimum | 7.0- 12.0 Gbr. 1 |
| Suhu optimum | 65 ℃ Gbr. 2 |
| stabilitas pH | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Gbr. 3 |
| Stabilitas termal | Di handap 50 ℃ (pH 8.0, 30 mnt) Gbr. 4 |
| Stabilitas gudang | Langkung ti 90% kagiatan salami 12 bulan dina 25 ℃ |
| Aktipator | SDS, uréa |
| Inhibitor | Diisopropil fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
Aplikasi
1. Kit diagnostik genetik
2. Kit ékstraksi RNA jeung DNA
3. Ekstraksi komponén non-protéin tina jaringan, degradasi pangotor protéin, kayaning DNAvaksin sareng persiapan heparin
4. Persiapan DNA kromosom ku éléktroforésis pulsed
5. blot Kulon
6. Énzimatik glycosylated albumin réagen dina diagnosis vitro
Tindakan pancegahan
Anggo sarung tangan pelindung sareng kacasoca nalika nganggo atanapi timbangan, sareng tetep ventilasi saé saatos dianggo.Produk ieu tiasa nyababkeun réaksi alérgi kulit sareng iritasi panon anu serius.Upami diseuseup, éta tiasa nyababkeun alergi atanapi gejala asma atanapi dyspnea.Bisa ngabalukarkeun iritasi engapan.
Harti Unit
Hiji unit (U) dihartikeun salaku jumlah énzim diperlukeun pikeun ngahidrolisis kasein pikeun ngahasilkeun 1 μmoltirosin per menit dina kaayaan di handap ieu.
Persiapan réagen
Réagen I: 1g susu kasein ieu leyur dina 50ml 0.1M leyuran natrium fosfat (pH 8.0), incubated dina 65-70 ℃ cai salila 15mins, diaduk jeung leyur, tiis ku cai, disaluyukeun ku natrium hidroksida ka pH 8.0, jeung volume tetep. 100 ml.
Réagen II: 0.1M asam trichloroacetic, 0.2M natrium asétat, 0.3M asam asétat.
Réagén III: 0,4M Na2CO3solusi.
Réagen IV: réagen Forint éncér jeung cai murni pikeun 5 kali.
Réagen V: Énzim éncér: 0.1M larutan natrium fosfat (pH 8.0).
Réagen VI: larutan tirosin: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosin leyur kalawan 0,2M HCl.
Prosedur
1. 0.5ml réagen I tos dipanaskeun nepi ka 37 ℃, tambahkeun 0.5ml leyuran énzim, campur ogé, sarta incubate di37 ℃ pikeun 10 menit.
2. Tambahkeun 1ml réagen II pikeun ngeureunkeun réaksina, aduk rata, terus inkubasi salila 30mins.
3. Solusi réaksi centrifugate.
4. Candak 0.5ml supernatant, tambahkeun 2.5ml réagen III, 0.5ml réagen IV, campur ogé jeung incubate dina 37 ℃pikeun 30 mnt.
5. OD660ieu ditangtukeun salaku OD1;grup kontrol kosong: 0.5ml réagen V dipaké pikeun ngaganti énzimsolusi pikeun nangtukeun OD660sakumaha OD2, ΔOD = OD1-OD2.
6. L-tirosin kurva baku: 0.5mL konsentrasi béda L-tirosin solusi, 2.5mL Réagen III, 0.5mL réagen IV dina 5mL tube centrifuge, incubate dina 37 ℃ pikeun 30mins, ngadeteksi keur OD660Pikeun konsentrasi L-tirosin anu béda, teras dicandak kurva standar Y=kX+b, dimana Y nyaéta konsentrasi L-tirosin, X nyaéta OD.600.
Itungan
2: Total volume leyuran réaksi (mL)
0,5: Volume larutan énzim (mL)
0.5: Volume cairan réaksi dipaké dina determinasi kromogenik (mL)
10: Waktu réaksi (mnt)
Df: Éncér sababaraha
C: Konsentrasi énzim (mg/mL)
Rujukan
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofisika.Res.Komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.jeung sajabana,Eur.J. Biokimia.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Kloning Molekul: Manual Laboratorium, édisi ka-2, Cold Spring HarbourLaboratorium Pencét, Cold Spring Harbour (1989).
Angka
buah ara.1 Optimal pH
100mM solusi panyangga: pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glisin-NaOH.Konsentrasi énzim:1mg/mL
Gbr.2 Suhu optimum
Réaksi dina 20 mM K-fosfat panyangga pH 8,0.Konsentrasi énzim: 1 mg/mL
Gbr.3 pH Stabilitas
25 ℃, 16 h-perlakuan jeung 50 mM solusi panyangga: pH 4,5- 5,5, Asétat;pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0-12.5, Glisin-NaOH.Konsentrasi énzim: 1 mg/mL
Gbr.4 Thermal stabilitas
30 mnt-perlakuan jeung 50 mM Tris-HCl panyangga, pH 8,0.Konsentrasi énzim: 1 mg/mL
Gbr.5 Panyimpenan stability at 25 ℃
