5×Neoscript Gancang RT-qPCR Premix tambah-UNG
Ucing No: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) mangrupikeun campuran basis usik hiji-tube anu stabil pisan pikeun transkripsi sabalikna hiji-hambalan sareng PCR kuantitatif (qRT-PCR).Éta ngadukung pra-campuran primer sareng panyilidikan sareng tetep stabil saatos neundeun waktos anu lami dina suhu rendah.Sampel anu bakal diuji tiasa ditambihkeun langsung nalika nganggo, tanpa operasi pipah / pipetting tambahan.Produk ieu nyadiakeun komponén, misalna panas-mimiti DNA polimérase, M-MLV, panas-labil uracil DNA glikosilase (TS-UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTPs (kalawan dUTP tinimbang dTTP), sarta penstabil.Kalayan reverse transcriptase amplifikasi gancang anu dirobih sacara genetik sareng polimérase DNA, tiasa ngarengsekeun amplifikasi PCR dina 20-40 menit.Réagen ieu ngagunakeun panyangga husus pikeun qPCR jeung énzim campuran énzim amplifikasi anti inhibitory jeung énzim UNG.Ku alatan éta, éta bisa ménta Gedekeun alus gén target sarta nyegah Gedekeun palsu disababkeun ku PCR residual na polusi aerosol.Réagen ieu cocog sareng kalolobaan instrumen PCR kuantitatif fluoresensi ti pabrik sapertos Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad sareng Roche.
Komponén
1.25 × Neoscript Gancang RTase / UNG Campur
2.5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP)
Kaayaan Panyimpenan
Sadaya komponén kedah dijaga dina -20 ℃ pikeun neundeun jangka panjang sareng 4 ℃ dugi ka 3 bulan.Mangga gaul tuntas sanggeus thawing na centrifuge saméméh ngagunakeun.Hindarkeun sering freeze-thaw.
qRT-PCR Réaksi System Persiapan
| Komponén | 25μLSistim | 50μLSistim | Konsentrasi ahir |
| 5×Neoscript Fast RT Premix Buffer (dUTP) | 5 μL | 10 μL | 1 × |
| 25 × Neoscript Gancang RTase / UNG Campur | 1 μL | 2 μL | 1 × |
| 25×Primer-usik Campura | 1 μL | 2 μL | 1 × |
| Citakan RNAb | – | – | – |
| ddH2O | Nepi ka 25μL | Nepi ka 50μL | – |
1) a.Konsentrasi ahir primer biasana 0.2μM.Pikeun hasil anu langkung saé, konsentrasi primer tiasa dioptimalkeun dina kisaran 0.2-1μM.Sacara umum, konsentrasi usik bisa dioptimalkeun dina rentang 0.1-0.3μM.
2) b.When maké Prosedur PCR gancang, ngaronjatna konsentrasi primers jeung panyilidikan bisa ngahasilkeun hasil amplifikasi hadé, sarta rasio maranéhanana kudu dioptimalkeun sasuai.
3) tipena béda sampel ngandung tipena béda jeung eusi inhibitor jeung nomer salinan gén target.Volume sampel kudu dianggap ku kaayaan sabenerna.Jieun éncér tina sampel kalawan cai nuclease bébas atawa TE Buffer, lamun perlu.
Réaksi Ckaayaan
| Prosedur PCR biasa | Prosedur PCR gancang | ||||||
| Prosedur | Temp. | Waktos | Siklus | Prosedur | Temp. | Waktos | Siklus |
| Transkripsi Ngabalikeun | 50 ℃ | 10-20 mnt | 1 | Transkripsi Ngabalikeun | 50 ℃ | 5 mnt | 1 |
| Polimérase Aktipkeun | 95 ℃ | 1-5 mnt | 1 | Polimérase Aktipkeun | 95 ℃ | 30s | 1 |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Denaturasi | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Anil jeung Ékstensi | 56-64 ℃ | 20-60s | Anil jeung Ékstensi | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Kontrol kualitas
1.Deteksi fungsi: sensitipitas, spésifisitas sareng kaulangan qPCR.
2.Taya aktivitas nuklease eksogen: euweuh polusi endonuclease exogenous na exonuclease.
Catetan
1.Laju amplifikasi DNA polimérase gancang teu kurang ti 1kb/10s.Alat PCR anu béda-béda gaduh kecepatan pemanasan sareng pendinginan anu béda, modeu kontrol suhu sareng konduktivitas termal, sahingga optimasi konsentrasi primer / panyilidikan anjeun sareng metode jalanna digabungkeun sareng alat PCR gancang khusus anjeun penting.
2.Produk ieu tiasa dianggo sacara lega, sareng cocog pikeun diagnosis molekular sensitipitas luhur.Métode PCR tilu léngkah disarankeun pikeun primer kalayan suhu anil anu rendah atanapi pikeun amplifikasi fragmen panjang langkung ti 200 bp.
3.Kusabab amplicons béda boga efisiensi utilization béda dUTP sarta sensitipitas béda mun UNG, réagen kudu dioptimalkeun lamun sensitipitas deteksi nurun nalika maké sistem UNG.Mangga ngahubungan kami pikeun rojongan teknis lamun diperlukeun.
4.Pikeun nyegah amplifikasi produk PCR, daérah ékspérimén khusus sareng pipette diperyogikeun pikeun amplifikasi.Beroperasi nganggo sarung tangan sareng sering robih sareng ulah muka tabung PCR saatos amplifikasi.
