EndoFree Plasmid Maxi Kit

Kaayaan neundeun

RNaseA kudu disimpen dina -30 ~ -15 ℃ sarta diangkut dina ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger bisa disimpen dina 2 ~ 8 ℃ salila sabulan, disimpen dina -30 ~ -15 ℃ pikeun neundeun jangka panjangsarta diangkut dina ≤0 ℃.

Komponén sanésna kedah disimpen dina suhu kamar (15 ~ 25 ℃) sareng diangkut dina suhu kamar.

Komponén

RNaseA:10 mg/ml, dipaké pikeun miceun RNA.

Panyangga P1:panyangga gantung baktéri, tambahkeun RNaseA ka panyangga P1 sateuacan dianggo heula.

Panyangga P2:panyangga lisis baktéri (ngandung SDS / NaOH).

Panyangga P4:panyangga neutralizing.

Éndotoksin Pamulung:éféktif ngaleungitkeun éndotoksin tina ekstrak plasmid atah.

Panyangga PW:nyeuseuh panyangga, tambahkeun volume stipulated étanol saméméh pamakéan munggaran.

Panyangga TB:panyangga élusi.

Kolom FastPure DNA Maxi:kolom adsorpsi DNA plasmid.

Tabung Koléksi 50 ml:tabung ngumpulkeun filtrate.

Tabung Koléksi Bébas Éndotoksin:tabung kumpulan DNA plasmid.

Bahan Disiapkeun

Étanol absolut, isopropanol, 50 ml tabung centrifuge buleud-handap sarta 50 ml bébas éndotoksin.tabung centrifuge.

Aplikasi

Produk ieu cocog pikeun ékstraksi skala ageung plasmid tina 150 - 300 ml larutan baktéri.dibudayakeun sapeuting.

Prosés ékspérimén

1. Nyokot 150 – 200 ml (teu leuwih ti 300 ml) larutan baktéri dibudidaya sapeuting jeung centrifuge dinakira-kira 11.000 rpm (12.000 × g) salila 1 – 2 mnt.Piceun supernatant jeung ngumpulkeun baktéri.

Δ Nalika ngumpulkeun leuwih ti 50 ml larutan baktéri, baktéri bisa dikumpulkeun ku nambahkeun leyuran baktéri, centrifugation, discarding supernatant jeung léngkah séjén dina tube 50 ml sarua pikeun

sababaraha kali.

2. Tambahkeun 7,5 ml panyangga P1 (mangga pariksa naha RNaseA geus ditambahkeun kana panyangga P1) kana centrifuge nutabung ngandung baktéri sarta campur tuntas ku vortex atanapi pipetting.

Δ Resuspensi lengkep baktéri dina léngkah ieu penting pikeun ngahasilkeun, sareng teu kedah aya gumpalan baktéri saatos resuspensi.Lamun aya rumpun baktéri anu teu tuntas dicampurkeun, éta bakal mangaruhan lysis, hasilna low ngahasilkeun sarta purity.Upami OD600 solusi baktéri nyaéta 0,65, disarankeun yén 7,5 ml panyangga P1 dianggo nalika ékstrak tina 150 ml larutan baktéri;lamun OD600 nyaeta 0,75, 8 ml panyangga P1 kudu dipaké sarta volume Buffers P2 na P4 kudu dirobah sasuai.Lamun volume leyuran baktéri ngaronjat nepi ka 200 ml, eta disarankeunvolume buffers P1, P2, jeung P4 ngaronjat sacara proporsional.

3. Tambahkeun 7,5 ml panyangga P2 kana suspénsi baktéri ti hambalan 2 jeung mix gently luhur jeung ka handap pikeun 6 – 8kali sarta incubate dina suhu kamar pikeun 4 - 5 mnt.

Δ Balikkeun gently pikeun nyampur tuntas.Vortexing bakal ngabalukarkeun fragméntasi DNA génomik, hasilna fragmen DNA génomik dina plasmid sasari.Dina waktos ieu, leyuran janten kentel tur tembus, némbongkeun yén baktéri geus pinuh lysed.Durasina henteu kedah langkung ti 5 menit pikeun nyegah karusakan plasmid.Lamun solusina teu jelas, meureun aya loba teuing baktéri hasilnalisis teu lengkep, ku kituna jumlah baktéri kudu ngurangan appropriately.

4. Tambahkeun 7,5 ml panyangga P4 kana gantung baktéri ti hambalan 3 jeung geura invert gently 6 - 8 kali pikeun ngidinan solusi pikeun sakabéhna neutralize panyangga P2.Dina waktos ieu, endapanan flocculent bodas kedah muncul.Centrifuge dina leuwih ti 11.000 rpm (12.000 × g) salila 10 - 15 mnt, taliti pipet supernatant kana tabung centrifuge 50 ml buleud-handap anyar (disiapkeun sorangan), sarta ulah aya.aspirasi endapan bodas ngambang.

Δ Tambahkeun panyangga P4 jeung geura balikkeun ka mix ogé.Ninggalkeun tabung nangtung nepi ka endapan bodas disebarkeun merata sakuliah solusi pikeun nyegah produksi présipitasi lokal nu bisa mangaruhan nétralisasi.Lamun teu aya endapanana flocculent bodas seragam saméméh centrifugation jeung supernatant teu jelas sanggeus centrifugation, tabung bisacentrifuged pikeun sejen 5 mnt.

5. Tambahkeun 0. 1 kali volume (10% tina volume supernatant, ngeunaan 2.2 ml) tina Endotoxin Scavenger kana supernatant ti hambalan 4 sarta balikkeun kana campuran.Teundeun solusi dina mandi és atawa selapkeun kana és ditumbuk (atawa freezer kulkas) salila 5 mnt nepi ka leyuran robah ti turbid jadi jelas tur transparan (atawa tetep.rada keruh), sarta aya kalana campur sababaraha kali.

Δ Saatos Endotoksin Scavenger ditambahkeun kana supernatant, supernatant bakal jadi keruh tapisupernatant kudu jelas (atawa rada turbid) sanggeus cooling dina mandi és.

6. Saatos supernatant disimpen dina suhu kamar (> 25 ℃) pikeun 10 - 15 mnt, éta bakal jadi turbid sakumahasuhu na naek ka suhu kamar.Lajeng superna-tant kudu inverted nyampur.

Δ Upami suhu kamar langkung handap atanapi anjeun hoyong ngirangan waktos ékstraksi, supernatan tiasa diinkubasi dina mandi cai 37 ~ 42 ℃ salami 5 - 10 mnt sareng léngkah salajengna tiasa dilaksanakeun saatos supernatan.janten keruh.

7. Centrifuge supernatant dina ngeunaan 11.000 rpm (12.000 × g) salila 10 mnt dina suhu kamar (suhu kudu > 25 ℃) pikeun misahkeun fase.Fase cai luhur ngandung DNA sedengkeun lapisan fase oily biru handap ngandung éndotoksin jeung pangotor lianna.Mindahkeun kaDNA-ngandung fase cai kana tube anyar jeungpiceun lapisan oily.

Δ Suhu salila centrifugation kudu leuwih 25 ℃ salaku separation fase éféktif henteulumangsung lamun suhu handap teuing.

Δ Lamun separation fase teu éféktif, hawa centrifugation bisa disaluyukeun jeung 30 ℃ jeungwaktos centrifugation bisa ngaronjat nepi ka 15 mnt.

Δ Ulah nyedot lapisan oily biru sabab ngandung éndotoksin jeung pangotor lianna.

Mékanisme

Netralisasi Lisis Resuspensi

◇ Tambahkeun 7,5 ml panyangga P1

◇ Tambahkeun 7,5 ml panyangga P2

◇ Tambahkeun 7,5 ml panyangga P4

Ngaleungitkeun éndotoksin

◇Tambahkeun 0. 1 kali volume supernatant Endotoxin Scavenger

Ngariung jeung Ngumbah

◇ Tambahkeun 0,5 kali volume isopropanol

◇ Tambahkeun 10 ml Buffer PW