Kit Mini Ekstraksi DNA
Kit ieu ngadopsi sistem panyangga anu dioptimalkeun sareng téknologi pemurnian kolom gél silika, anu tiasa pulih 70 bp - 20 kb fragmen DNA tina sababaraha konsentrasi TAE atanapi TBE agarose gél.Kolom adsorpsi DNA sacara khusus tiasa nyerep DNA dina kaayaan uyah anu luhur.Salaku tambahan, kit éta tiasa langsung ngamurnikeun fragmen DNA tina produk PCR, sistem réaksi énzimatik atanapi produk DNA kasar anu dicandak ku metode sanés, sareng ngaleungitkeun pangotor sapertos protéin, sanyawa organik sanés, ion uyah anorganik sareng primer oligonukleotida.Bisa mastikeun yén purifikasi bisa réngsé dina 10-15min.DNA anu dimurnikeun tiasa dianggo langsung pikeun ligasi, transformasi, nyerna énzim, transkripsi in vitro, PCR, sequencing, microinjection, jsb.
Kaayaan neundeun
Nyimpen dina -15 ~ -25 ℃ sarta angkutan dina suhu kamar.
Komponén
| Komponén | (100 rxns) |
| PDB panyangga | 80 ml |
| Panyangga GW | 2 × 20 ml |
| Élusi panyangga | 20 ml |
| FastPure DNA Mini Kolom-G | 100 |
PDB panyangga:panyangga mengikat DNA.
Panyangga GW:panyangga cuci;tambahkeun étanol mutlak ku volume anu dituduhkeun dina botol sateuacan dianggo.
panyangga élusi:Élusi.
FastPure DNA Mini Columns-G:Kolom adsorpsi DNA.
Tabung Koléksi 2 ml:Koléksi tabung pikeun filtrate.
Bahan Disiapkeun
1,5 ml tabung sterilized, étanol mutlak jeung isopropanol (lamun fragmen DNA ≤100 bp, tambahkeun 1 volume
isopropanol kana 1 volume gél), mandi cai.
Prosés ékspérimén
Tambahkeun 80 ml étanol pikeun éncér Buffer GW sakumaha dituduhkeun dina tag saméméh pamakéan, nyimpen dina suhu kamar.
Mékanisme
1. solusi réaksi PCR
Skéma ékstraksi gél: Tambahkeun volume sarua panyangga GDP PCR skéma recovery solusi réaksi:Tambahkeun 5 kali volume panyangga
2. GDP Ngitung volume gél (100 μl sarua 100 mg)
Ngaleyurkeun gél
3. Preheat dina 50 ~ 55℃
4. Ngumbah Ngumbah
Tambahkeun 300 μL PDB Buffer*
Tambahkeun 700 μL Buffer GW
Tambahkeun 700 μL Buffer GW
5. Elute
Tambahkeun 20 - 30μL Elution Buffer atanapi cai deionisasi
Catetan* Pamulihan cairan réaksi PCR tanpa léngkah ieu
Program ékstraksi gél
1. Saatos éléktroforésis DNA pikeun fractionating fragmen DNA, excise strip tunggal fragmen DNA tina gél agarose handapeun sinar UV.Disarankeun make kertas absorbent pikeun nyerep Uap katempo tina gél jeung ngaleutikan ukuran keureut gél ku nyoplokkeun tambahan agarose sabisa mungkin.Timbang irisan gél (tanpa tabung microcentrifuge) pikeun ngitung volumena: Volume 100 mg gelslice kira-kira 100 μL, asumsina dénsitasna 1g/ml.
2. Tambahkeun volume sarua panyangga GDP, incubate di 50 ~ 55 ℃ pikeun 7-10 mnt (nurutkeun ukuran gél, saluyukeun waktos inkubasi nepi ka gél sagemblengna leyur).Balikkeun tabung 2 kali salami inkubasi.
Δ Nambahan 1-3 jilid GDP panyangga moal mangaruhan efisiensi recovery DNA.Lamun sempalan DNA bakal pulih <100 bp, 3 volume panyangga GDP perlu ditambahkeun;nalika nyiksikan gél geus leyur lengkep, tambahkeun 1 volume isopropanol jeung mix tuntas, lajeng neruskeun lengkah saterusna.
3. Centrifuge sakeudeung mawa sampel ka handap tabung, selapkeun FastPure DNA Mini Columns-G kana Tabung Koléksi 2 ml, taliti mindahkeun solusi maximally 700 μL sakali a
waktos ka kolom filtrasi, centrifuge dina 12.000 rpm (13.800 X g) salila 30-60 detik.
4. Piceun filtrate jeung nambahkeun 300 μL GDP panyangga kana kolom, incubate dina suhu kamar pikeun 1 mnt, centrifuge dina 12.000 rpm (13.800 X g) pikeun 30-60 detik.
5. Piceun filtrate jeung tambahkeun 700 μL panyangga GW (pariksa lamun étanol mutlak geus ditambahkeun sateuacanna!) kana kolom, centrifuge dina 12.000 rpm (13.800 X g) salila 30-60 detik.
Δ Mangga tambahkeun panyangga GW sabudeureun témbok kolom adsorption, atawa tambahkeun panyangga GW panutup tukang sarta campur eta tibalik ka handap pikeun 2 - 3 kali pikeun mantuan lengkep siram uyah adhering kana témbok tube.
6. Malikan deui léngkah 5.
Δ Flushing kalawan panyangga GW dua kali bisa mastikeun yén uyah sagemblengna dipiceun sarta ngaleungitkeun dampak dina percobaan saterusna.
7. Piceun filtrate jeung centrifuge kolom kosong dina 12.000 rpm (13.800 X g) salila 2 mnt.
8. Selapkeun kolom kana tube microcentrifuge bersih 1,5 ml, tambahkeun 20 - 30 μL Elution panyangga ka puseur mémbran kolom, incubate pikeun 2 mnt, lajeng centrifuge dina 12.000 rpm (13.800 X g) pikeun 1 mnt.Piceun kolom, nyimpen DNA diala dina -20 .
Δ Mindahkeun supernatan lengkah 8 ka kolom pikeun elute deui jeung preheating Elution Buffer ka 55 (lamun fragmen DNA> 3 kb) meureun mantuan pikeun ngaronjatkeun efisiensi recovery.
Program pamulihan produk PCR
Protokol ieu tiasa dianggo pikeun ngamurnikeun fragmen DNA tina produk PCR, sistem réaksi énzimatik sareng produk kasar DNA sanés (kalebet DNA genetik).Leyuran ieu éfisién bisa miceun rupa nukléotida, primers, dimer primer, molekul uyah, énzim jeung pangotor lianna.
1. Sakeudeung centrifuge produk PCR, solusi réaksi énzimatik, jeung produk atah DNA lianna.Estimasi volume maranéhanana jeung pipette jeung mindahkeun kana sterilized 1,5 ml atawa 2 ml tube.Tambahkeun ddH2O nepi ka volume nepi ka 100 μL;Sedengkeun pikeun DNA génomik kalawan konsentrasi luhur, éncér nepi ka 300 μL kalawan ddH2O bakal mantuan pikeun ngaronjatkeun efisiensi recovery.
2. Tambahkeun 5 jilid GDP panyangga, campur tuntas ku inverting atanapi vortexing.Lamun fragmen DNA dipikaresep> 100 bp, tambahan 1,5 volume (sampel + Buffer GDP) étanol perlu ditambahkeun.
3. Selapkeun kolom deui kana tabung kempelan, mindahkeun mixtrue kana kolom, centrifuge dina 12.000 rpm (13.800 × g) pikeun 30 - 60 detik.Lamun volume solusi campuran nyaeta> 700 µL, nempatkeun kolom adsorption deui kana tabung koleksi, mindahkeun sésana solusi kana kolom adsorption, sarta centrifuge dina 12.000 rpm (13.800 × g) pikeun 30 - 60 detik.
4. kinerja salajengna nujul kana hambalan 5 - 8 ti 08- 1 / program ékstraksi gél.
Aplikasi
Rupa-rupa konsentrasi TAE atanapi TBE agarose gél;Produk PCR, sistem réaksi énzimatik atawa produk DNA kasar lianna diala ku rupa-rupa métode.fragmen pulih dibasajankeun70 bp -20 kb.
Catetan
Pikeun pamakéan panalungtikan wungkul.Henteu kanggo dianggo dina prosedur diagnostik.
1. Tambahkeun 80 ml étanol pikeun éncér panyangga GW sakumaha dituduhkeun dina tag saméméh pamakéan, nyimpen dina suhu kamar.
2. Lamun GDP panyangga gampang endapanana salila neundeun-suhu low, éta bisa ditempatkeun dina suhu kamar pikeun periode waktu saméméh pamakéan.Upami diperlukeun, éta bisa dipanaskeun dina mandi cai 37 ℃ nepi ka endapanana sagemblengna leyur, lajeng bisa dipaké sanggeus Pergaulan.
3. Atur suhu cai mandi ka 50 ~ 55 ℃ sateuacanna.
4. Dina 08-1 / program ékstraksi gél hambalan 1, ngaminimalkeun ukuran keureut gél nyata bakal ngurangan waktu ngabubarkeun jeung ngaronjatkeun efisiensi recovery (DNA linierisasi gampang hidrolisis lamun terus kakeunaan dina suhu luhur).Ulah ngalaan gél DNA kana UV pikeun lila, sabab sinar ultraviolét bisa ngabalukarkeun karuksakan DNA.
5. Ngaleyurkeun gél dina 08- 1 / program ékstraksi gél hambalan 2 lengkep, disebutkeun efisiensi recovery DNA bakal kapangaruhan serius.
6. Preheat Elution panyangga atanapi ddH2O ka 55 ℃, nu mantuan pikeun ngaronjatkeun efisiensi élusi DNA.Disarankeun pikeun nyimpen DNA dina eluent 2,5 mM Tris-HCl, pH 7,0 - 8,5.
