RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase nyaéta polimérase DNA anu gumantung kana citakan RNA anu teu boga aktivitas exonuclease 3'→5' sarta boga aktivitas RNase H.Énzim ieu tiasa nganggo RNA salaku citakan pikeun nyintésis untaian komplementer DNA, anu tiasa diterapkeun kana sintésis cDNA untaian kahiji, khususna pikeun RT-LAMP (amplifikasi isothermal loop-mediated).Dibandingkeun sareng RTL reverse transcriptase 1.0, sensitipitasna ningkat sacara signifikan, stabilitas termal langkung kuat, sareng réaksi dina 65 ° C langkung stabil.RTL reverse transcriptase (gliserol bébas) bisa dipaké pikeun nyiapkeun persiapan lyophilized, réagen RT-LAMP lyophilized jsb.
Harti Unit
Hiji unit ngasupkeun 1 nmol dTTP kana bahan présipitasi asam dina 20 menit dina suhu 50°C maké poly(A)•oligo(dT)25 salaku template-primer.
Komponén
| Komponén | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Gliserol bébas) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL panyangga | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Kaayaan Panyimpenan
Transportasi handapeun 0 ° C sarta disimpen dina -25 ° C ~ -15 ° C.
Kontrol kualitas
- Kagiatan sésa tinaEndonuklease:Réaksi 50 μL ngandung 1 μg λDNA sareng 15 unit RTL2.0 diinkubasi salami 16 jam dina suhu 37 ℃ nunjukkeun pola anu sami sareng kontrol négatip ku éléktroforésis gél.
- Kagiatan sésa tinaExonuclease:Réaksi 50 μL ngandung 1 μg Hind Ⅲ dicerna λDNA sareng 15 unit RTL2.0 diinkubasi salami 16 jam dina suhu 37 ℃ nunjukkeun pola anu sami sareng kontrol négatip ku éléktroforésis gél.
- Kagiatan sésa tinaNickase:Réaksi 50 μL ngandung 1 μg pBR322 supercoiled sareng 15 unit RTL2.0 diinkubasi salami 4 jam dina suhu 37 ° C nunjukkeun pola anu sami sareng kontrol négatip ku éléktroforésis gél.
- Kagiatan sésa tinaRNase:Réaksi 10 μL ngandung 0,48 μg MS2 RNA sareng 15 unit RTL2.0 diinkubasi salami 4 jam dina suhu 37 ° C nunjukkeun pola anu sami sareng kontrol négatip ku éléktroforésis gél.
- E. coli gDNA:Diukur kalawanE.colikit deteksi HCD husus, 15 unit RTL2.0 ngandung kirang ti 1E. coligénom.
Setup Réaksi
Protokol Sintésis cDNA
| Komponén | Jilid |
| Citakan RNA a | pilihan |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) atawa campuran Primer Acak(60uM) | 2 μl |
| Campuran dNTP (masing-masing 10mM) | 1 μL |
| Inhibitor RNase (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL panyangga | 2 μl |
| Cai nukléase-gratis | Nepi ka 20 μL |
Catetan:
1) Dosis anu disarankeun tina Total RNA nyaéta 1ng ~ 1μg
2) Dosis mRNA anu disarankeun nyaéta 50ng~100ng
Termo-Ngabuburit Kaayaan keur rutin a réaksi:
| Suhu (°C) | Waktos |
| 25 °Ca | 5 mnt |
| 55 °C | 10 mntb |
| 80 °C | 10 mnt |
Catetan:
1) Lamun Random Primer Mix dipaké, hiji hambalan inkubasi dina 25 ° C.
2) Lamun campuran Primer target dipaké, hiji hambalan inkubasi dina 55 ° C pikeun 10 ~ 30mins.
RT-lampu Protocol
| Komponén | Jilid | Konsentrasi ahir |
| Citakan RNA | pilihan | ≥10 éksemplar |
| Campuran dNTP (10mM) | 3,5 l | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primer (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Primer F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Primer LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U / Réaksi |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U / Réaksi |
| Bst V2 DNA Polimérase (8U/μL) | 1 μL | 8 U / Réaksi |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (atanapi 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 l | 1 × (2mM Mg2+) |
| Cai nukléase-gratis | Nepi ka 25 μL | - |
Catetan:
1) Campur ku vortexing na centrifuge sakeudeung pikeun ngumpulkeun.Inkubasi suhu konstan dina 65 ° C salila 1 jam.
2) Dua panyangga tiasa dioperasikeun sareng gaduh komposisi anu sami.
Catetan
1.Produk ieu bakal ngabentuk solid bodas lamun disimpen dina -20 °C.Angkat kaluar tina -20 ° C teras nahan kana és salami 10 menit.Saatos lebur, éta tiasa dianggo ku oyag sareng campur.
2.Produk cDNA bisa disimpen dina -20 °C atawa -80 °C atawa dipaké langsung pikeun réaksi PCR.
3.Pikeun nyegah kontaminasi RNase, mangga jaga wewengkon ékspérimén beresih, sarta maké sarung tangan beresih jeung masker salila operasi.
