Tutuwuhan langsung PCR Kit
Cat No: HCR2020A
Kit PCR Langsung Tutuwuhan cocog pikeun amplifikasi langsung daun tutuwuhan, siki, sareng sajabana, sareng tiasa dianggo pikeun saringan tinggi-throughput tina conto pepelakan anu henteu ngandung polisakarida sareng polifenol.Polimérase DNA amplifikasi langsung dumasar kana évolusi anu diarahkeun ngagaduhan kasabaran anu langkung luhur pikeun sambetan PCR dina pepelakan.Samentara éta, éta ngajaga kinerja amplifikasi tinggi, nu cocog pikeun amplifikasi fragmen DNA dina 5 kb.Lysis panyangga A unik dina kit bisa dipaké pikeun lyse jaringan tutuwuhan seger atawa beku.Gampang beroperasi sareng lysate tiasa dianggo salaku template pikeun amplifikasi tanpa purifikasi.Sistem ieu ngandung agén pelindung anu ngamungkinkeun sampel atah sacara efektif digedékeun saatos katirisan sareng pencairan.2 × Tutuwuhan Langsung Master Campur ngan perlu nambahkeun primers na template pikeun ngalakukeun réaksi amplifikasi, kukituna ngurangan operasi pipetting sarta ngaronjatkeun throughput deteksi na reproducibility hasil.
Komponén
| Komponén | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Tutuwuhan langsung Master Campur | 1,25 ml | 4 × 1,25 ml |
| Penyangga Lisis Langsung Tumbuhan A | 5 ml | 20 ml |
| Panyangga Lisis Langsung Tutuwuhan B* | 5 ml | 20 ml |
*Tutuwuhan Langsung Lysis Panyangga B mangrupa réagen pilihan, nu dipaké pikeun neutralize Plant Langsung Lysis panyangga A pikeun prolonging waktu neundeun sampel.Ieu bisa dipaké nurutkeun kaayaan sabenerna.
Kaayaan Panyimpenan
2 × Tutuwuhan Langsung Master Campuran, simpen dina -30 ~ -15 ℃ sareng nyingkahan katirisan sareng thawing;Tutuwuhan Langsung Lysis panyangga, nyimpen dina -30 ~ -15 ℃ atawa 2 ~ 8 ℃.
Prosés ékspérimén
Ngolah Sampel–Daun Tutuwuhan
Métode langsung:Disarankeun ngagunakeun daun ngora.Paké punch liang kalayan diaméter tetep 0,5 - 3 mm pikeun ménta sampel leutik tur seragam, lajeng langsung nambahkeun sampel kana sistem PCR (50 μl Sistim dianjurkeun).Catetan, pastikeun sampel dina leyuran PCR teu ngalawan témbok tube.Lamun PCR langsung dipaké pikeun ngagedékeun fragmen panjang sarta sampel kompléks, ngagunakeun sampel kalayan diaméter leutik (0,5 - 1 mm) salaku citakan bisa mantuan pikeun ménta hasil hadé.
Métode lysis grinding:Disarankeun ngagunakeun daun ngora.Candak sapotong leutik daun (kira-kira 1 - 3 mm diaméterna), nempatkeun eta dina 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, sarta grind eta saloba mungkin (léngkah ieu bisa dipigawé ku squeezing daun jeung 100 μl pipette tip. pikeun mash sampel).Upami volume jaringan daun anu langkung ageung dianggo (henteu langkung ti 7 mm), ningkatkeun volume panyangga éncér kana 50 μl.Saatos daun digiling, solusina kedah némbongan héjo.Saatos sentrifugasi sakedap, tambahkeun 1 μl supernatan kana sistem PCR salaku template réaksi.
Métode lisis termal:Disarankeun ngagunakeun daun ngora.Nyokot sapotong leutik daun (kira-kira 1 - 3 mm diaméterna), nempatkeun eta dina 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, jeung panas eta dina 95 ° C salila 5 - 10 mnt.Waktu lisisna tiasa diperpanjang kanggo daun anu hese lisekeun (henteu langkung ti 20 mnt).Upami volume jaringan daun anu langkung ageung dianggo (henteu langkung ti 7 mm), ningkatkeun volume panyangga éncér kana 50 μl.Saatos pemanasan, centrifuge sakeudeung, sarta tambahkeun 1 μl supernatant kana sistem PCR salaku template réaksi b.
Ngolah Sampel– Bibit tutuwuhan
Métode lysis grinding:Anggo scalpel pikeun motong siki kalayan diaméter 5 mm, tambahkeun kana 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, sareng ngagiling sampel nganggo tip pipette atanapi alat-alat sanés.Vortex sakeudeung sarta ngantep nangtung dina suhu kamar pikeun 3 - 5 mnt.Pastikeun sampel siki teuleum dina panyangga éncér.Saatos sentrifugasi sakedap, tambahkeun 1 μl supernatan kana sistem PCR salaku template réaksi.
Métode lisis termal:Anggo scalpel pikeun motong siki kalayan diaméter 5 mm, tambahkeun kana 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, sareng panas dina 95 ° C salami 5 - 10 mnt.Waktos lisis tiasa diperpanjang kanggo daun anu hese lisis (henteu langkung ti 30 mnt).Saatos pemanasan, centrifuge sakeudeung, sarta tambahkeun 1 μl supernatant kana sistem PCR salaku template réaksi b.
a.Gunting atawa parabot lianna ogé bisa dipaké pikeun motong sampel ukuran cocog;lamun punch atawa gunting anu dipaké deui, maranéhanana kudu cleaned kalawan 2% leyuran natrium hypochlorite saméméh unggal pamakéan pikeun nyegah cross-kontaminasi antara sampel.
b.Pastikeun yén Plant Direct Lysis Buffer pinuh dilebur sateuacan dianggo.Upami panyanggana kentel atanapi gaduh endapan, éta tiasa dipanaskeun dina 37 ℃ pikeun ngalembereh lengkep sateuacan dianggo.
c.Volume template dina sistem réaksi bisa disaluyukeun appropriately nurutkeun bédana dina volume bahan tutuwuhan jeung diluent ditambahkeun.
Tutuwuhan Lysis panyangga langsung
Panyangga Lysis Langsung Tutuwuhan anu aya dina produk ieu parantos dioptimalkeun sacara ketat pikeun ngaleupaskeun génom kalolobaan jaringan pepelakan sareng cocog pikeun neundeun jangka pondok pepelakan atah dina suhu 4 ℃.Upami sampel kedah disimpen kanggo waktos anu langkung lami (contona, 1 - 2 bulan), disarankeun pikeun mindahkeun supernatan ka tabung EP énggal sareng disimpen dina -20 ℃.Pikeun nyimpen sampel leuwih stably, tambahkeun hiji volume sarua Plant Direct Lysis panyangga B kana supernatant dipindahkeun, campur ogé tur nyimpen dina -20 ℃.Waktu neundeun stabil beda-beda jeung sampel tutuwuhan jeung kaayaan.
Sistem Réaksi
| ddH2O | Nepi ka 20,0 µl | Nepi ka 50,0 µl |
| 2 × Tutuwuhan langsung Master Campura | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Sampel daun tutuwuhan / ekstrak kasar(Tingali kana Ngolah Sampel) | Cakram daun 0,5 – 3 mm/x µl | Cakram daun 0,5 – 3 mm/x µl |
a.Ieu ngandung Mg2+dina konsentrasi ahir 2 mM.
b.Disarankeun ngagunakeun konsentrasi ahir 0,4μM pikeun unggal primer.Pamakéan primers kaleuleuwihan bakal ngakibatkeun ngaronjat amplifikasi nonspésifik.
c.Jumlah sampel dipaké bisa disaluyukeun nurutkeun kaayaan sabenerna.Jumlah dipaké dina réaksi tunggal sampel lysed atah bisa disaluyukeun antara 2% - 20% tina total volume réaksi.Ngagunakeun teuing sampel bisa ngabalukarkeun gagalna amplifikasi.
Program Réaksi
| Léngkah | Suhu | Waktos |
| Denaturasi awal | 98 ℃ | 5 mnt |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10 detik |
| Anil | 58 ~ 72 ℃ | 15 detik |
| Ékstensi | 72 ℃ | 30 detik |
| Extension Final | 72 ℃ | 5 mnt |
a.Denaturasi Awal (98 ℃, 5 mnt) promotes lisis jaringan tutuwuhan, ngaleupaskeun DNA génomik nu bisa dipaké pikeun amplifikasi PCR.Ulah shorten waktu atawa ngurangan hawa.
b.Disarankeun pikeun nyetél éta sarua jeung nilai Tm primer atawa 2 ~ 4 ℃ leuwih luhur ti nilai Tm.Polimérase DNA amplifikasi langsung anu digunakeun dina produk ieu béda ti polimérase DNA Taq konvensional, sareng gaduh syarat khusus pikeun suhu reaksi annealing; panggunaan suhu annealing anu luhur sacara efektif tiasa ngirangan amplifikasi nonspésifik sareng ningkatkeun efisiensi amplifikasi.Pikeun témplat kompléks, amplifikasi efisien tiasa dihontal ku nyaluyukeun suhu annealing sareng manjangkeun waktos ekstensi.
c.Lamun panjang produk amplifikasi nyaeta ≤1 kb, waktos extension disetel dina 30 detik / kb;lamun panjang produk amplifikasi nyaeta> 1 kb, waktos extension disetel dina 60 detik / kb.
d.Pikeun sampel kompléks atawa sampel kalawan ngahasilkeun amplifikasi low, jumlah siklus bisa appropriately ngaronjat kana 40 -50 siklus.
Aplikasi
Ieu lumaku pikeun amplifikasi langsung jaringan tutuwuhan jeung saringan tinggi-throughput sampel tutuwuhan nu teu ngandung polisakarida jeung polifenol.
Catetan
Pikeun pamakéan panalungtikan wungkul.Henteu kanggo dianggo dina prosedur diagnostik.
1. Pikeun amplifikasi tutuwuhan atah atawa amplifikasi langsung, disarankeun pikeun ngagunakeun DNA génomik dimurnikeun salaku kontrol positif saméméh dimimitian percobaan pikeun mastikeun yén sistem, primers jeung operasi anu bener.
2. Polimérase DNA amplifikasi langsung anu digunakeun dina kit ieu gaduh kagiatan proofreading anu kuat.Upami Kloning TA kedah dilakukeun, disarankeun pikeun ngamurnikeun DNA sateuacan nambihan adénin.
3. Pituduh Desain Primer:
a.Disarankeun yén dasar terakhir dina tungtung 3′ primer kedah G atanapi C.
b.mismatches padeukeut kudu dihindari dina panungtungan 8 basa dina 3' tungtung Primer.c.Hindarkeun struktur jepit rambut dina tungtung 3′ primer.
d.Beda dina nilai Tm tina primer maju jeung primer sabalikna teu kudu leuwih ti 1 ℃ sarta nilai Tm kudu disaluyukeun kana 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 disarankeun pikeun ngitung nilai Tm).
e.Sekuen Primer tambahan tambahan nu teu cocog jeung citakan, teu kudu kaasup nalika ngitung nilai Tm Primer.
f.Disarankeun yén eusi GC tina primer janten 40% -60%.
g.Sebaran sakabéh A, G, C jeung T dina primer kedah saloba mungkin.Hindarkeun nganggo daérah anu eusi GC atanapi AT tinggi.
h.Hindarkeun ayana runtuyan komplementer tina 5 basa atawa leuwih boh dina primer atawa antara dua primers sarta ulah aya runtuyan komplementer 3 basa atawa leuwih dina tungtung 3′ dua primers.
abdi.Anggo fungsi NCBI BLAST pikeun mariksa spésifisitas primer pikeun nyegah amplifikasi nonspésifik.
