Énzim Capping Virus Vaccinia
Énzim capping virus Vaccinia diturunkeun tina galur E. coli rékombinan mawa gén pikeun énzim capping Vaccinia.Enzim tunggal ieu diwangun ku dua subunit (D1 sareng D12) sareng gaduh tilu kagiatan énzimatik (RNA triphosphatase sareng guanylyltransferase ku subunit D1 sareng guanin methyltransferase ku subunit D12).Virus Vaccinia Capping Enzyme éféktif pikeun ngatalisan formasi struktur cap, nu husus bisa ngagantelkeun struktur cap 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) kana tungtung 5′ RNA.Struktur tutup (Cap 0) muterkeun hiji peran penting dina stabilisasi mRNA, transpor jeung translasi dina eukariot.Capping RNA ku réaksi énzimatik mangrupikeun metode anu efektif sareng saderhana anu sacara signifikan tiasa ningkatkeun stabilitas sareng tarjamahan RNA pikeun transkripsi in vitro, transfeksi, sareng microinjection.
Komponén
Énzim Capping Virus Vaccinia (10 U/μL)
10 × Capping panyangga
Kaayaan neundeun
-25～- 15℃ pikeun neundeun (Hindarkeun siklus freeze-thaw)
Panyangga gudang
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% gliserol.
Harti Unit
Hiji unit Vaccinia virus Capping Enzyme diartikeun salaku jumlah énzim anu diperlukeun pikeun ngasupkeun 10pmol GTP kana transkrip 80nt dina 1 jam dina suhu 37°C.
Kontrol kualitas
Exonuclease:10U of Vaccinia virus Capping Enzyme kalawan 1μg λ-Hind III nyerna DNA dina 37 ℃ salila 16 jam teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.
Éndonuclease:10U of Vaccinia virus Capping Enzyme kalawan 1μg λDNA dina 37 ℃ salila 16 jam teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.
Nickase:10U of Vaccinia virus Capping Enzyme kalawan 1 μg pBR322 dina 37 ℃ salila 16 jam teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.
RNase:10U of Vaccinia virus Capping Enzyme kalawan 1.6μg MS2 RNA salila 4 jam dina suhu 37 ℃ teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.
1.coli DNA:10U of Vaccinia virus Capping Enzyme disaring pikeun ayana E. coli DNA génomik maké TaqMan qPCR kalawan primers husus pikeun E. coli 16S rRNA locus.Kontaminasi DNA génomik E. coli nyaéta≤1 génom E. coli.
2.Baktéri Éndotoksin: LAL-test, nurutkeun Cina Pharmacopoeia IV 2020 édisi, gél wates test metoda, aturan umum (1143).Eusi éndotoksin baktéri kudu ≤10 EU/mg.
Sistim réaksi jeung kaayaan
1. Protokol Capping (volume réaksi: 20 μL)
Prosedur ieu lumaku pikeun réaksi capping 10μg RNA (≥100 nt) jeung bisa diskalakeun up nurutkeun tungtutan eksperimen.
I) Gabungkeun 10μg RNA sareng H2O bébas Nukléase dina tabung mikrofuge 1,5 ml dugi ka volume akhir 15,0 µL.*10×Capping Panyangga: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)
2) Panas dina 65 ℃ salila 5 menit dituturkeun ku és mandi salila 5 menit.
3) Tambahkeun komponén di handap dina urutan dieusian
| Componén | Volume |
| RNA didenaturasi (≤10μg, panjang≥100 nt) | 15 μL |
| 10 × Capping Panyangga* | 2 μl |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Énzim Capping virus Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
*10×Capping Panyangga:0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8.0)
4) Inkubasi dina 37 ° C salila 30 menit, RNA ayeuna capped tur siap pikeun aplikasi hilir.
2. 5′ terminal réaksi labél (volume réaksi: 20 μL)
Protokol ieu dirancang pikeun labél RNA anu ngandung 5' trifosfat sareng tiasa diskalakeun dumasar kana paménta.Efisiensi tina incorporation labél bakal dipangaruhan ku rasio molar RNA: GTP, ogé eusi GTP dina sampel RNA.
1) Gabungkeun jumlah RNA sareng H2O bébas Nuklease anu pas dina tabung mikrofuge 1,5 ml dugi ka volume akhir 14,0 µL.
2) Panas dina 65 ℃ salila 5 menit dituturkeun ku és mandi salila 5 menit.
3) Tambahkeun komponén di handap dina urutan dieusian.
| Componén | Volume |
| RNA didenaturasi | 14 μl |
| 10 × Capping panyangga | 2 μl |
| Campuran GTP** | 2 μl |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Énzim Capping virus Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX nujul kana GTP jeung sajumlah leutik spidol.Pikeun konsentrasi GTP, tingalka Catetan 3.
4) Inkubasi dina 37 ° C salila 30 menit, tungtung RNA 5′ ayeuna dilabélan tur siap pikeun hilir.
Aplikasi
1. Capping mRNA saméméh translasi assays/translasi in vitro
2. Labeling 5' tungtung mRNA
Catetan dina pamakéan
1.Pemanasan leyuran RNA saméméh inkubasi ku Vaccinia Capping Énzim ngaleungitkeun struktur sekundér dina tungtung 5' transkrip.Manjangkeun waktos ka 60 menit kanggo transkrip sareng 5' tungtung anu dipikanyaho.
2. RNA dipaké pikeun réaksi capping kudu dimurnikeun saméméh pamakéan sarta ditunda dina cai nuclease-bebas.EDTA henteu kedah aya sareng solusina kedah bébas tina uyah.
3. Pikeun labél tungtung 5', total konsentrasi GTP kudu sabudeureun 1-3 kali konsentrasi molar mRNA dina réaksi.
4. Volume sistem réaksi bisa diskalakeun ka luhur atawa ka handap nurutkeun sabenerna.
