PNGase F
Péptida-N-Glycosidase F(PNGase F) nyaéta métode énzimatik nu paling éféktif pikeun miceun ampir kabéh oligosakarida nu numbu N tina glikoprotein.PNGase F mangrupa amidase, nu ngabeulah antara résidu GlcNAc paling jero jeung asparagine tina mannose tinggi, hibrida, jeung oligosakarida kompléks tina glikoprotein numbu N.
Aplikasi
Énzim ieu mangpaat pikeun ngaleungitkeun résidu karbohidrat tina protéin.
Persiapan jeung spésifikasi
| Penampilan | Cairan teu warnaan |
| Purity protéin | ≥95% (tina SDS-PAGE) |
| Kagiatan | ≥500.000 U/mL |
| Exoglycosidase | Teu aya kagiatan anu tiasa dideteksi (ND) |
| Éndoglycosidase F1 | ND |
| Éndoglycosidase F2 | ND |
| Éndoglycosidase F3 | ND |
| Éndoglycosidase H | ND |
| Protéase | ND |
Pasipatan
| Nomer EC | 3.5.1.52(Rekombinan tina mikroorganisme) |
| Beurat molekular | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 8. 14 |
| pH optimum | 7.0-8.0 |
| Suhu optimum | 65 °C |
| Spésifikasi substrat | Memotong beungkeut glikosidik antara GlcNAc sareng résidu asparagin Gbr.1 |
| situs pangakuan | Glikan numbu N iwal ngandung α1-3 fucose Gbr. 2 |
| Aktipator | DTT |
| Panghambat | SDS |
| Suhu neundeun | -25 ~-15 ℃ |
| Inactivation panas | Campuran réaksi 20µL anu ngandung 1µL PNGase F dinonaktipkeun ku inkubasi dina suhu 75 °C salami 10 menit. |
Gbr. 1 spésifisitas substrat PNGase F
Gbr. 2 Pangakuan sits PNGase F.
Nalika résidu GlcNAc internal numbu ka α1-3 fucose, PNGase F teu bisa megatkeun oligosakarida nu numbu N tina glikoprotein.Modifikasi ieu umum dina tutuwuhan sareng sababaraha glikoprotein serangga.
Componén
|
| Komponén | Konsentrasi |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10 × Glikoprotein Denaturing panyangga | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Harti Unit
Hiji unit(U) dihartikeun salaku jumlah énzim diperlukeun pikeun miceun> 95% tina karbohidrat tina 10 µg RNAase B didenaturasi dina 1 jam dina 37 ° C dina total volume réaksi 10 µL.
Kaayaan réaksi
1. Leyurkeun 1-20 µg glikoprotein jeung cai deionisasi, tambahkeun 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer jeung H2O (lamun perlu) pikeun nyieun volume réaksi total 10 µl.
2.Inkubasi dina 100 ° C salila 10 menit, tiis kana és.
3.Tambahkeun 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 jeung mix.
4.Tambahkeun 1-2 µl PNGase F jeung H2O (lamun perlu) pikeun nyieun 20 µl total volume réaksi jeung mix.
5.Inkubasi réaksi dina 37 ° C salila 60 mnt.
6.Pikeun analisis SDS-PAGE atawa analisis HPLC.
