mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

mRNA Cap 2'-O-methyltransferase diturunkeun tina galur E. coli rékombinan anu mawa gén pikeun vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferase.Énzim ieu nambihan gugus métil dina posisi 2'-O tina nukléotida munggaran anu padeukeut sareng struktur tutup dina tungtung 5' RNA. Énzim ngagunakeun S-adenosylmethionine (SAM) salaku donor métil pikeun métilasi RNA katutupan (cap). -0) hasilna cap- 1 struktur.

Struktur Cap1 bisa ningkatkeun efisiensi tarjamah, ngaronjatkeun ekspresi mRNA dina transfection na microinjection experiments.This énzim husus merlukeun RNA kalawan cap m7GpppN salaku substrat.Éta henteu tiasa ngagunakeun RNA sareng pN, ppN, pppN atanapi GpppN dina tungtung 5'.RNA Capped bisa disiapkeun ngaliwatan transkripsi in vitro maké cap analog atawa ngaliwatan capping énzimatik maké Vaccinia Capping Enzyme.

Komponén

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)

10 × Capping Réaksi panyangga

Panyimpenan

-25 ～- 15 ℃ pikeun neundeun （ Hindarkeun siklus freeze-thaw terus-terusan）

Panyangga gudang

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% gliserol.

Harti Unit

Hiji unit dihartikeun salaku jumlah énzim diperlukeun pikeun métilasi 10 pmoles tina transkrip RNA katutupan 80 nt dina 1 jam dina 37 ° C.

Assays kontrol kualitas

Exonuclease:50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kalawan 1μg λ-Hind III nyerna DNA dina 37 ℃ salila 16 jam teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.

Éndonuklease: 50 U tina mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kalawan 1 μg λDNA dina 37 ℃ salila 16 jam teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.

Nickase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kalawan 1μg pBR322 dina 37 ℃ salila 16 jam teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.

RNase: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase kalawan 1.6μg MS2 RNA salila 4 jam dina 37 ℃ teu ngahasilkeun degradasi sakumaha ditangtukeun ku éléktroforésis gél agarose.

E. coli DNA: 50U mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase disaring pikeun ayanaE. coli DNA génomik maké TaqMan qPCR kalawan primers husus pikeunE. coli 16S rRNA lokus.TheE. coli kontaminasi DNA génomik nyaéta =1E. coli génom.

Baktéri Éndotoksin: LAL-test, nurutkeun Cina Pharmacopoeia IV 2020 édisi, gél wates test metoda, aturan umum (1143).Eusi endotoksin baktéri kedahna = 10 EU/mg.

Sistim réaksi jeung kaayaan

1. Gabungkeun jumlah anu pas tina Capped RNA sareng H2O bébas RNase dina tabung mikrofuge 1,5 mL dugi ka volume akhir 16,0 µL.

2. Panas dina 65 ℃ salila 5 menit dituturkeun ku mandi és salila 5 menit.

3. Tambahkeun komponén di handap dina urutan dieusian (pikeun methylation of Capped RNA

kirang ti 10

*10× Capping Réaksi Panyangga: 500 mM Tris-HCl(pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT.

4. Incubate dina 37 ℃ pikeun 1 jam (2 jam inkubasi disarankeun pikeun fragmen target kirang ti 200 nt).

Aplikasi

Pikeun ngaronjatkeun éksprési mRNA salila microinjection na transfection percobaan.

Catetan dina pamakéan

1. Saméméh réaksi, RNA kudu dimurnikeun jeung leyur dina cai nuclease bébas, kabéh solusi teu kudu ngandung EDTA jeung ion.

2. Disarankeun pikeun memanaskeun sampel RNA dina 65 ℃ salila 5 mnt saméméh réaksi ngaleupaskeun struktur sekundér dina 5' tungtung transkrip.Bisa diperpanjang nepi ka 10 mnt pikeun struktur terminal 5´-kompléx.