M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase dicandak ku téknologi rékayasa genetik.Éta gaduh kamampuan sintésis cDNA anu langkung luhur, stabilitas termal sareng wates suhu réaksi (dugi ka 60 ° C).Produk cDNA anu disintésis dugi ka 10 kb.Éta ningkatkeun afinitas témplat sareng cocog pikeun transkripsi ngabalikeun témplat RNA kalayan struktur sekundér kompléks atanapi gen salinan rendah.
Komponén
| Komponén | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript panyangga | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Kaayaan Panyimpenan
Produk ieu kedah disimpen dina -25 ° C ~ -15 ° C salami 2 taun.
Harti Unit
Hiji unit ngasupkeun 1 nmol dTTP kana bahan nu teu larut asam dina 10 menit dina suhu 37°C ngagunakeun Oligo(dT) salaku primers.
Setup Réaksi
1.Denaturasi template RNA (Lengkah ieu opsional, denaturasi template RNA mantuan pikeun muka struktur sekundér, nu bakal ngaronjatkeun ngahasilkeun cDNA untaian kahiji.)
| Komponén | Volume (μL) |
| RNase bébas ddH2O | Ka 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) atawa Primer Acak (50 μmol/L) Atawa Primer Spésifik Gén (2 μmol/L) | 1 |
| atawa 1 | |
| atawa 1 | |
| RNA template | X a |
Catetan:
1) a: Total RNA: 1-5 ug atawa mRNA: 1-500 ng
2) Inkubasi dina 65 ° C salila 5 menit, lajeng mindahkeun dina és geuwat chill salila 2 menit.Centrifugation ringkes pikeun ngumpulkeun cairan réaksi, tambahkeun solusi réaksi transkripsi sabalikna sakumaha ditémbongkeun dina tabel di handap ieu.Gently pipette pikeun nyampur.
1.Nyiapkeun campuran réaksi (volume 20 μL)
| Komponén | Volume (μL) |
| Campuran léngkah saméméhna | 13 |
| 5 × panyangga | 4 |
| Campuran dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Laksanakeun réaksi dina kaayaan di handap ieu:
| Suhu (°C) | Waktos |
| 25 °Ca | 5 mnt |
| 42 °Cb | 15-30 mnt |
| 85 °Cc | 5 mnt |
Catetan:
1) a.Inkubasi dina 25 ° C salila 5 menit ngan diperlukeun pikeun ngagunakeun hexamers acak.Mangga skip léngkah ieu nalika nganggo Oligo (dT)18atanapi Gene Spésifik Primer.
2) b.Suhu transkripsi sabalikna anu disarankeun nyaéta 42 ° C, Pikeun témplat kalayan struktur sekundér pajeulit atanapi eusi GC anu luhur, disarankeun pikeun ningkatkeun suhu réaksi ka 50-55 ° C.
3) c.Pemanasan dina 85 ° C salami 5 menit pikeun nganonaktipkeun reverse transcriptase.
4) produk bisa langsung dipaké dina PCR atawa réaksi qPCR, atawa disimpen dina -20 ° C pikeun neundeun jangka pondok.Disarankeun pikeun aliguot produk jeung nyimpen dina -80 ° C pikeun neundeun jangka panjang.Hindarkeun sering freeze-thaw.
5) produk nu cocog pikeun hiji-hambalan RT-qPCR, eta disarankeun pikeun nambahkeun 10-20 U transcriptase sabalikna pikeun unggal sistem réaksi 25μL, atawa laun ningkatkeun jumlah transcriptase sabalikna nurutkeun kaayaan sabenerna.
Catetan
1.Mangga tetep wewengkon percobaan bersih;Sarung tangan bersih sareng masker kedah dianggo salami operasi.Sadaya bahan anu dianggo dina percobaan kedah bébas RNase pikeun nyegah kontaminasi RNase.
2.Sadaya prosedur kedah dilakukeun dina és pikeun nyegah degradasi RNA.
3.Sampel RNA kualitas luhur disarankeun pikeun mastikeun efisiensi luhur transkripsi sabalikna.
4.Produk ieu kanggo dianggo panalungtikan wungkul.
5.Mangga beroperasi kalawan jas lab jeung sarung disposable, pikeun kaamanan Anjeun.
