M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase mangrupakeun transcriptase sabalikna diala ku screening mutasi gén M-MLV tina Moloney murine leukemia virus asal jeung ekspresi dina E.coli.Énzim ngaleungitkeun kagiatan RNase H, gaduh kasabaran suhu anu langkung luhur, sareng cocog pikeun transkripsi sabalikna suhu luhur.Ku alatan éta, éta mantuan pikeun ngaleungitkeun épék teu nguntungkeun tina struktur tingkat tinggi RNA jeung faktor non-spésifik dina sintésis cDNA, sarta mibanda stabilitas luhur jeung kamampuhan sintésis transkripsi sabalikna.Énzim ngagaduhan stabilitas anu langkung luhur sareng kamampuan sintésis transkripsi sabalikna.
Komponén
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × Panyangga Untaian Pertama (opsional)
* 5 × First-Strand Buffer henteu ngandung dNTP, mangga tambahkeun dNTP nalika nyiapkeun sistem réaksi
Aplikasi Disarankeun
1.Hiji-hambalan qRT-PCR.
2.Deteksi virus RNA.
Kaayaan Panyimpenan
-20 ° C pikeun neundeun jangka panjang, kudu dicampur ogé saméméh pamakéan, ulah sering freeze-ngalembereh.
Harti Unit
Hiji unit ngandung 1 nmol dTTP dina 10 menit dina suhu 37°C ngagunakeun poli(A)•oligo(dT)25salaku template / primer.
Kontrol kualitas
1.SDS-PAGE purity electrophoretic leuwih gede ti 98%.
2.Sensitipitas amplifikasi, kontrol bets-to-batch, stabilitas.
3.Henteu aya kagiatan nuklease eksogen, teu aya kontaminasi endonuklease atanapi kontaminasi eksogen
Setup Réaksi pikeun Solusi Réaksi Chain Kahiji
1.Nyiapkeun campuran réaksi
| Komponén | Jilid |
| Oligo(dT)12-18 Primer atawa Primer acaka Atawa Primers Spésifik Geneb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Citakan RNA | Total RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH bébas RNase2O | Nepi ka 10 μL |
Catetan:a / b: Mangga pilih tipena béda primers nurutkeun pangabutuh eksperimen Anjeun.
2.Panas dina 65 ° C salila 5 menit sarta tiis gancang dina és salila 2 menit.
3.Tambahkeun komponén di handap kana sistem di luhur kana volume total 20µL jeung mix gently:
| Komponén | Volume (μL) |
| 5 × Mimiti-Strand panyangga | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH bébas RNase2O | Nepi ka 20 μL |
4.Please ngalakukeun réaksi nurutkeun kaayaan di handap ieu:
(1) Mun Random Primer dipaké, réaksina kudu dilaksanakeun dina 25 ℃ pikeun 10mins, lajeng dina 50 ℃ pikeun 30 ~ 60mins;
(2) Upami Oligo dT atanapi primer khusus dianggo, réaksina kedah dilaksanakeun dina 50 ℃ salami 30 ~ 60 menit.
5.Panas dina 95 ℃ salami 5 menit pikeun nganonaktipkeun Neoscript Reverse Transcriptase sareng ngeureunkeun réaksina.
6.Produk transkripsi sabalikna tiasa dianggo langsung dina réaksi PCR sareng réaksi PCR kuantitatif fluoresensi, atanapi disimpen dina -20 ℃ kanggo waktos anu lami.
PCR Rtindakan:
1.Nyiapkeun campuran réaksi
| Komponén | Konsentrasi |
| 10 × PCR Buffer (bébas dNTP, bébas Mg²+) | 1 × |
| dNTPs (10mM unggal dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polimérase (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Citakana | ≤10% Solusi Réaksi Ranté Kahiji (2 μL) |
| ddH2O | Nepi ka 50 μL |
Catetan:a: Lamun teuing mimiti solusi réaksi ranté ditambahkeun, réaksi PCR bisa jadi dipeungpeuk.
2.Prosedur Réaksi PCR
| Lengkah | Suhu | Waktos | Siklus |
| Pra-denaturasi | 95 ℃ | 2-5 mnt | 1 |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10-20 detik | 30-40 |
| Anil | 50-60 ℃ | 10-30 detik | |
| Ékstensi | 72 ℃ | 10-60 detik |
Catetan
1.Cocog jeung optimasi hawa transkripsi sabalikna dina rentang 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Éta gaduh stabilitas anu langkung saé, cocog pikeun amplifikasi transkripsi sabalikna suhu luhur.Sajaba ti éta, éta nguntungkeun pikeun éfisién ngaliwatan wewengkon struktural kompléks RNA.Ogé, étacocog pikeun hiji-hambalan multiplex fluoresensi kuantitatif RT-PCR deteksi.
3.Kasaluyuan anu saé sareng sababaraha énzim amplifikasi PCR sareng cocog pikeun réaksi RT-PCR sensitipitas luhur.
4.Cocog jeung sensitipitas tinggi hiji-hambalan fluoresensi kuantitatif réaksi RT-PCR, éféktif ngaronjatkeun laju deteksi konsentrasi low tina citakan.
5.Cocog jeung konstruksi perpustakaan cDNA.
