RNA untaian ganda (dsRNA) ELISA KIT
Kit ieu mangrupikeun Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) gandeng sareng sistem biotin-Streptavidin, pikeun pangukuran kuantitatif dsRNA anu panjangna di luhur 60 pasangan basa(bp), henteu paduli urutanna.Pelatna parantos dilapis ku antibodi anti-dsRNA.dsRNA hadir dina sampel ditambahkeun jeung ngabeungkeut antibodi coated on sumur.Lajeng antibodi anti-dsRNA biotinilated ditambahkeun jeung ngabeungkeut dsRNA dina sampel.Saatos ngumbah, HRP-Streptavidin ditambahkeun sareng ngabeungkeut antibodi anti-dsRNA Biotinylated.Saatos inkubasi unbound HRP-Streptavidin dikumbah jauh.Lajeng solusi substrat TMB ditambahkeun jeung dikatalisis ku HRP pikeun ngahasilkeun produk warna bulao nu robah jadi konéng sanggeus nambahkeun solusi eureun asam.Kapadetan konéng sabanding sareng jumlah target dsRNA anu kawengku dina piring.Nyerepna diukur dina 450 nm.
Aplikasi
Kit ieu kanggo pangukuran kuantitatif residual dsRNA.
komponén Kit
|
| Komponén | HCP0033A-1 | HCP0033A-2 |
| 1 | Elisa Microplate | 8×6 | 8× 12 |
| 2 | Antibodi Detéksi Biotinilasi (100x) | 60 μL | 120 μL |
| 3 | Hrp-Streptavidin (100x) | 60 μL | 120 μL |
| 4 | Panyangga éncér | 15ml | 30 ml |
| 5 | Solusi substrat Tmb | 6 ml | 12 ml |
| 6 | Eureun Solusi | 3 ml | 6 ml |
| 7 | Penyangga cuci kentel (20x) | 20 ml | 40 ml |
| 8 | Standar (UTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 9 | Standar (pUTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 10 | Standar (N1-Me-pUTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 11 | Standar (5-OMe-UTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 12 | STE panyangga | 25 ml | 50 ml |
| 13 | Lempeng Sealer | 2 sapotong | 4 potongan |
| 14 | Instruksi Manual jeung COA | 1 salinan | 1 salinan |
Panyimpenan sareng Stabilitas
1. Pikeun kit henteu kapake: Sakabeh kit bisa disimpen dina 2 ~ 8 ℃ dina kahirupan rak.Cahaya anu kuat kedah dihindari pikeun stabilitas neundeun.
2. Pikeun dipaké kit: Sakali microplate dibuka, punten nutupan sumur henteu kapake kalawan sealer plat sarta balik deui ka pouch foil ngandung pak desiccant, pos-segel pouch foil sarta balik deui ka 2 ~ 8 ℃ pas mungkin sanggeus pamakéan.réagen séjén kudu balik ka 2 ~ 8 ℃ pas mungkin sanggeus pamakéan.
Bahan Diperlukeun Tapi Henteu Disadiakeun
1. Microplate maca kalawan 450 ± 10nm filter (hadé lamun bisa ngadeteksi dina panjang gelombang 450 sarta 650 nm).
2. Microplate shaker.
3. tips RNase bébas tur tabung centrifuge.
Bagan alir Operasi
Sateuacan Anjeun Ngawitan
1. Bawa sadaya komponén kit sareng conto ka suhu kamar (18-25 ℃) sateuacan dianggo.Upami kit éta henteu tiasa dianggo dina hiji waktos, punten ukur kaluarkeun jalur sareng réagen pikeun percobaan ayeuna, sareng tinggalkeun sésa-sésa sareng réagen dina kaayaan anu diperyogikeun.
2. Nyeuseuh panyangga: éncér 40mL of 20 × kentel nyeuseuh panyangga jeung 760mL deionized atawa cai sulingan pikeun nyiapkeun 800mL 1 × nyeuseuh panyangga.
3. Standar: spin sakeudeung atawa centrifuge solusi stock saméméh pamakéan.Konsentrasi opat standar anu disayogikeun nyaéta 5ng/μL.Pikeun standar UTP jeung pUTP dsRNA, mangga éncér solusi stock kana 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL kalawan panyangga STE pikeun ngagambar kurva baku.Pikeun standar dsRNA N1-Me-pUTP, mangga éncér solusi stock kana 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL kalawan panyangga STE pikeun ngagambar kurva baku.Pikeun standar dsRNA 5-OMe-UTP, punten éncér solusi saham kana 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL sareng panyangga STE pikeun ngagambar kurva standar.Kami ngarékoméndasikeun standar tiasa éncér sapertos bagan ieu:
|
N1-Me-pUTP dsRNA standar | |||
|
No. |
Pamungkas Con. (pg/μL) | instruksi éncér | |
| STE panyangga |
standar | ||
|
A
B C D E F G H | 100
2
1 0.5 0.25 0. 125 0,0625 0.0312 0 | 49 μl
490 μL
250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL | 1μL 5ng/μL baku 10 μL 100 pg / μL solusi 250 μL larutan A 250 μL larutan B 250 μL larutan C 250 μL larutan D 250 μL solusi E 250 μL solusi F / |
| Pikeun standar dsRNA 5-OMe-UTP | |||
|
No. |
Pamungkas Con. (pg/μL) | instruksi éncér | |
| STE panyangga |
standar | ||
|
A
B C D E F G H |
100
4
2 1 0.5 0.25 0. 125 0,0625 0 |
49 μl
480 μL
250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL | 1μL 5ng/μL standar 20μL 100pg/μL solusi 250 μL larutan A 250 μL larutan B 250 μL larutan C 250 μL larutan D 250 μL solusi E 250 μL solusi F / |
4. Antibodi deteksi biotinylated sareng solusi kerja HRP-streptavidin: spin sakedap atanapi centrifuge solusi saham sateuacan dianggo.Éncér aranjeunna kana konsentrasi kerja kalayan panyangga éncér.
5. TMB substate: aspirate dosage diperlukeun tina solusi kalawan tips sterilized sarta ulah dump solusi residual kana vial deui.Substate TMB sénsitip kana cahaya, ulah paparan substrat TMB kana cahaya kanggo waktos anu lami.
Ngagunakeun protokol
1. Nangtukeun jumlah strips diperlukeun pikeun assay.Selapkeun strips dina pigura pikeun pamakéan.Sésana strips piring teu dipaké dina assay ieu kudu repacked dina kantong jeung desiccant.Tutup kantong pageuh pikeun neundeun refrigerated.
2. Tambahkeun 100μL unggal dilutions tina standar, kosong jeung sampel kana sumur luyu.Panutup ku piring sealer.Inkubasi 1 jam dina suhu kamar kalayan oyag dina 500 rpm.Sampel kedah éncér sareng panyangga STE pikeun konsentrasi anu pas pikeun uji akurat.
3. Lengkah nyeuseuh: Aspirate leyuran jeung ngumbah kalawan 250μL nyeuseuh panyangga ka unggal sumur sarta ngantep éta nangtung pikeun 30s.Piceun nyeuseuh panyangga lengkep ku snap piring onto kertas absorbent.Sakabehna ngumbah 4 kali.
4. Tambahkeun 100μL tina biotinylated solusi gawé antibodi deteksi kana unggal sumur.Panutup ku piring sealer.Inkubasi 1 jam dina suhu kamar kalayan oyag dina 500 rpm.
5. Ngulang léngkah nyeuseuh.
6. Tambahkeun 100μL solusi kerja HRP-streptavidin kana unggal sumur.Panutup ku piring sealer.Inkubasi salila 30 menit dina suhu kamar kalayan oyag dina 500 rpm.
7. Ngulang léngkah nyeuseuh deui.
8. Tambahkeun 100μL larutan substrat TMB kana unggal sumur.Panutup ku piring sealer.Inkubasi 30 mnt di RT Protect tina cahaya.Cairan bakal bulao ku nambahkeun solusi substrat.
9. Tambahkeun 50μL solusi eureun kana unggal sumur.Cairan bakal ngahurungkeun konéng ku nambahkeun solusi eureun.Teras ngajalankeun pamaca microplate sareng ngalaksanakeun pangukuran dina 450nm langsung.
Itungan Hasil
1. Rata-rata bacaan duplikat pikeun tiap standar, kontrol, jeung sampel sarta ngurangan dénsitas optik standar enol rata.Ngawangun kurva baku kalawan absorbance dina vertikal (Y) sumbu jeung dsRNA konsentrasi dina horizontal (X) sumbu.
2. Disarankeun nedunan itungan jeung software kurva-pas basis komputer kayaning ahli kurva 1.3 atanapi ELISA Calc dina 5 atawa 4 parameter model non-linier fit.
Performance
1. Sensitipitas:
wates handap deteksi: ≤ 0.001pg/μL (pikeun UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (pikeun 5-OMe-UTP-dsRNA).
wates handap quantitation: 0,0156 pg / μL (pikeun UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg / μL (pikeun N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg / μL (pikeun 5-OMe-UTP-dsRNA).
2. Precision: CV of Intra-Assay ≤10%, CV of Inter-Assay ≤10%
3. Pamulihan: 80% ~ 120%
4.Linearitas: 0.0156-0.5pg/μL(pikeunUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(pikeunN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(pikeun 5-OMe-UTP-dsRNA).
Pertimbangan
1. Suhu réaksi TMB sarta waktu kritis, mangga ngadalikeun aranjeunna nurutkeun parentah ketat.
2. Dina raraga ngahontal reproducibility assay alus tur sensitipitas, cuci ditangtoskeun tina pelat pikeun miceun kaleuwihan réagen un-diréaksikeun penting.
3. Kabéh réagen kudu dicampur tuntas saméméh pamakéan sarta ulah aya bumbles salila sampel atawa réagen tambahan.
4. Lamun kristal geus kabentuk dina nyeuseuh panyangga kentel (20x), haneut nepi ka 37 ℃ jeung mix gently nepi ka kristal sagemblengna leyur.
5. Hindarkeun assay sampel nu ngandung Natrium Azide (NaN3), sabab bisa ngancurkeun aktivitas HRP hasilna underestimasi tina jumlah dsRNA.
6. Hindarkeun kontaminasi RNase salila assay.
7. Standar / sampel, antibodi deteksi jeung SA-HRP ogé bisa dipigawé di RT tanpa oyag, tapi ieu bisa ngabalukarkeun sensitipitas deteksi panurunan ku hiji-melu.Pikeun hal ieu, kami nyarankeun standar UTP sareng pUTP dsRNA kedah éncér tina 2pg/μL, standar dsRNA N1-Me-pUTP kedah éncér tina 4pg/μL sareng standar dsRNA 5-OMe-UTP kedah éncér tina 8pg/μL.Salaku tambahan, inkubasi solusi kerja HRP-streptavidin salami 60 menit dina suhu kamar.Ulah make flask shaker, sabab flask shaker bisa ngakibatkeun hasil teu akurat.
Hasil has
1. Data kurva baku
| konsentrasi (pg/μl) | N1-Me-pUTP dirobah standar dsRNA | ||
| OD450-OD650(1) | OD450-OD650(2) | RATA-RATA | |
| 2 | 2.8412 | 2.7362 | 2.7887 |
| 1 | 1.8725 | 1.9135 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.0863 | 1.1207 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.623 | 0,6055 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3388 | 0.3292 | 0.3340 |
| 0,0625 | 0.1947 | 0.1885 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0. 1192 | 0.1247 | 0.1220 |
| 0 | 0,0567 | 0,0518 | 0.0543 |
2. Itungan kurva baku
3. rentang deteksi Liner: 0,0312- 1pg / μL
| Konsentrasi (pg/μl) | OD450-OD650 |
| 1 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3340 |
| 0,0625 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0.1220 |
